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貴陽稀疏高亮標記方法實現(xiàn)全腦范圍單神經(jīng)元完整重構(gòu)
腦連接圖譜研究是神經(jīng)生物學主要的研究課題之一。以往研究主要注重于描繪大腦中的不同腦區(qū)之間以及不同位置神經(jīng)元類群之間的連接。雖然這些腦連接圖譜揭示了神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)，但由于缺乏單細胞精度，腦區(qū)水平或神經(jīng)元類群水平的連接圖譜并不能準確反映神經(jīng)系統(tǒng)的精細結(jié)構(gòu)。目前，有兩個因素限制了單神經(jīng)元連接譜的研究進展：一方面，為了清晰分辨單神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，需要對神經(jīng)元進行稀疏高亮標記；另一方面，需要高精度高通量的成像系統(tǒng)來獲得全腦成像，并需要特殊圖像處理技術(shù)進行神經(jīng)元重構(gòu)。
針對第一個問題，羅敏敏實驗室開發(fā)了一種基于AAV的表達系統(tǒng)，可以稀疏、高亮地標記特定類型的神經(jīng)元。這一標記系統(tǒng)由兩個AAV載體兩組成：
1）控制子（Controller），由TRE啟動子與Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的FLPo編碼序列；
2）放大子（Amplifier），由TRE啟動子和FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA編碼序列。
這兩個病毒需混合后進行腦內(nèi)注射。混合病毒侵染神經(jīng)元后，若神經(jīng)元內(nèi)無Cre表達，則標記不發(fā)生。當病毒感染Cre陽性神經(jīng)元后，控制子中的Cre依賴的轉(zhuǎn)錄元件會被翻轉(zhuǎn)。由于此時神經(jīng)元內(nèi)沒有tTA表達，TRE啟動子轉(zhuǎn)錄活性低。在大多數(shù)被病毒侵染的Cre陽性神經(jīng)元中FLPo表達量極低，無法觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。隨機的，在某些Cre陽性神經(jīng)元中，F(xiàn)LPo表達量達到一定的水平，觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。
由于放大子同樣使用TRE啟動子，轉(zhuǎn)錄活性低，只有少量的GFP和tTA表達。此時，在極少量細胞內(nèi)tTA的表達量達到一定水平，足以結(jié)合TRE啟動子并啟動其后基因的轉(zhuǎn)錄，正反饋回路被觸發(fā)：細胞表達更多的FLPo對剩余的放大子組件進行翻轉(zhuǎn)，并使更多的GFP和tTA被表達出來，標記強度得到增強
。
該系統(tǒng)的設(shè)計有兩個優(yōu)點：
1）由于標記的觸發(fā)依賴于Cre，通過將該稀疏標記系統(tǒng)與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)用，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞類型特異性的稀疏標記；
2）通過調(diào)整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標記的稀疏程度。
基于這一標記系統(tǒng)，羅敏敏課題組與華中科技大學國家光電研究中心fMOST課題組合作，建立了“稀疏標記-樣本包埋-fMOST成像-神經(jīng)元重構(gòu)-數(shù)據(jù)校準-量化分析”的流水線，實現(xiàn)了穩(wěn)定高通量的全腦成像和圖像分析。借助這一流水線，研究人員在DAT-Cre小鼠中重構(gòu)了15個中腦多巴胺神經(jīng)元的完整形態(tài)。
通過單細胞形態(tài)學分析，研究人員能夠?qū)⒅貥?gòu)的多巴胺神經(jīng)元分為兩類：一類多巴胺神經(jīng)元只有單個投射目標，軸突在終點處會形成密集的末端樹狀分支；另一類投射軸突分布比較廣泛，會有多個旁分支投向不同目標，少有末端樹狀分支。
研究人員利用不同血清型的AAV病毒，進一步拓展了稀疏標記系統(tǒng)，實現(xiàn)了投射特異性的神經(jīng)元稀疏標記。利用此方法并結(jié)合fMOST成像，研究人員成功對皮層-紋狀體投射神經(jīng)元進行特異性標記和完整重構(gòu)。
組織透明化是近期成像領(lǐng)域?qū)矣型黄频募夹g(shù)。研究人員將稀疏標記系統(tǒng)與組織透明結(jié)合，在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特異性的標記了兩類中間神經(jīng)元，制成腦片后用uDISCO方法進行透明化處理。隨后在共聚焦顯微鏡下成像，并對對神經(jīng)元進行了重構(gòu)。通過此方法，研究人員實現(xiàn)了中間神經(jīng)元的快速重構(gòu)，并且可以高效地對神經(jīng)元樹突的分支特征進行量化分析。
該稀疏標記系統(tǒng)的另一大優(yōu)點是可拓展性高。最初版本的稀疏標記系統(tǒng)中，研究人員利用了Cre和FLP這一對重組酶。通過引入新的重組酶，理論上可以構(gòu)建與Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏標記系統(tǒng)，以實現(xiàn)在同一樣本內(nèi)對不同種類神經(jīng)元的多色標記。為了驗證此策略，研究人員引入了DreO和vCre這一對新的重組酶，構(gòu)建了DreO/vCre版本的稀疏標記系統(tǒng)。利用Cre/FLP和DreO/vCre兩個版本的稀疏標記系統(tǒng)，研究人員成功實現(xiàn)在同一鼠腦內(nèi)對兩群神經(jīng)元進行雙色稀疏標記。
針對第一個問題，羅敏敏實驗室開發(fā)了一種基于AAV的表達系統(tǒng)，可以稀疏、高亮地標記特定類型的神經(jīng)元。這一標記系統(tǒng)由兩個AAV載體兩組成：
1）控制子（Controller），由TRE啟動子與Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的FLPo編碼序列；
2）放大子（Amplifier），由TRE啟動子和FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA編碼序列。
這兩個病毒需混合后進行腦內(nèi)注射。混合病毒侵染神經(jīng)元后，若神經(jīng)元內(nèi)無Cre表達，則標記不發(fā)生。當病毒感染Cre陽性神經(jīng)元后，控制子中的Cre依賴的轉(zhuǎn)錄元件會被翻轉(zhuǎn)。由于此時神經(jīng)元內(nèi)沒有tTA表達，TRE啟動子轉(zhuǎn)錄活性低。在大多數(shù)被病毒侵染的Cre陽性神經(jīng)元中FLPo表達量極低，無法觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。隨機的，在某些Cre陽性神經(jīng)元中，F(xiàn)LPo表達量達到一定的水平，觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。
由于放大子同樣使用TRE啟動子，轉(zhuǎn)錄活性低，只有少量的GFP和tTA表達。此時，在極少量細胞內(nèi)tTA的表達量達到一定水平，足以結(jié)合TRE啟動子并啟動其后基因的轉(zhuǎn)錄，正反饋回路被觸發(fā)：細胞表達更多的FLPo對剩余的放大子組件進行翻轉(zhuǎn)，并使更多的GFP和tTA被表達出來，標記強度得到增強
。
該系統(tǒng)的設(shè)計有兩個優(yōu)點：
1）由于標記的觸發(fā)依賴于Cre，通過將該稀疏標記系統(tǒng)與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)用，能夠?qū)崿F(xiàn)細胞類型特異性的稀疏標記；
2）通過調(diào)整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標記的稀疏程度。
基于這一標記系統(tǒng)，羅敏敏課題組與華中科技大學國家光電研究中心fMOST課題組合作，建立了“稀疏標記-樣本包埋-fMOST成像-神經(jīng)元重構(gòu)-數(shù)據(jù)校準-量化分析”的流水線，實現(xiàn)了穩(wěn)定高通量的全腦成像和圖像分析。借助這一流水線，研究人員在DAT-Cre小鼠中重構(gòu)了15個中腦多巴胺神經(jīng)元的完整形態(tài)。
通過單細胞形態(tài)學分析，研究人員能夠?qū)⒅貥?gòu)的多巴胺神經(jīng)元分為兩類：一類多巴胺神經(jīng)元只有單個投射目標，軸突在終點處會形成密集的末端樹狀分支；另一類投射軸突分布比較廣泛，會有多個旁分支投向不同目標，少有末端樹狀分支。
研究人員利用不同血清型的AAV病毒，進一步拓展了稀疏標記系統(tǒng)，實現(xiàn)了投射特異性的神經(jīng)元稀疏標記。利用此方法并結(jié)合fMOST成像，研究人員成功對皮層-紋狀體投射神經(jīng)元進行特異性標記和完整重構(gòu)。
組織透明化是近期成像領(lǐng)域?qū)矣型黄频募夹g(shù)。研究人員將稀疏標記系統(tǒng)與組織透明結(jié)合，在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特異性的標記了兩類中間神經(jīng)元，制成腦片后用uDISCO方法進行透明化處理。隨后在共聚焦顯微鏡下成像，并對對神經(jīng)元進行了重構(gòu)。通過此方法，研究人員實現(xiàn)了中間神經(jīng)元的快速重構(gòu)，并且可以高效地對神經(jīng)元樹突的分支特征進行量化分析。
該稀疏標記系統(tǒng)的另一大優(yōu)點是可拓展性高。最初版本的稀疏標記系統(tǒng)中，研究人員利用了Cre和FLP這一對重組酶。通過引入新的重組酶，理論上可以構(gòu)建與Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏標記系統(tǒng)，以實現(xiàn)在同一樣本內(nèi)對不同種類神經(jīng)元的多色標記。為了驗證此策略，研究人員引入了DreO和vCre這一對新的重組酶，構(gòu)建了DreO/vCre版本的稀疏標記系統(tǒng)。利用Cre/FLP和DreO/vCre兩個版本的稀疏標記系統(tǒng)，研究人員成功實現(xiàn)在同一鼠腦內(nèi)對兩群神經(jīng)元進行雙色稀疏標記。
相比于現(xiàn)有的稀疏標記方法，羅敏敏課題組開發(fā)的這一稀疏標記策略具有易使用、易拓展、效率高的特點。除了文章中展示的分子特異性或投射特異性標記，理論上該系統(tǒng)也可以與光遺傳學分子、分子探針、CRISPR/Cas9元件等聯(lián)用，用于單細胞水平功能性研究。這一技術(shù)的開發(fā)將有助于將腦連接譜研究推向單細胞精度，并有希望幫助研究人員在單細胞精度下對正常及病理狀態(tài)的神經(jīng)元進行研究。
貴州吉創(chuàng)生物技術(shù)有限公司主營涉及生物技術(shù)、醫(yī)學生物、動物實驗、藥品研發(fā)及其相關(guān)的實驗耗材試劑、設(shè)備儀器、實驗化學品及實驗技術(shù)服務(wù)等相關(guān)業(yè)務(wù)?？沙薪用庖哂≯E實驗（western blot）、酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）、動物實驗、細胞培養(yǎng)實驗、細胞藥品篩查實驗（MTT）等各類型實驗項目。是目前貴州省范圍內(nèi)首家獨立經(jīng)營的，擁有專職技術(shù)團隊及獨立實驗室的生物技術(shù)服務(wù)類公司。公司團隊致力于打造貴州省較為完善生物實驗技術(shù)服務(wù)交流平臺。
