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常規(guī)傳代細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮儲(chǔ)存罐中取出一支凍存的細(xì)胞種子，迅速放入36℃~40℃水中，快速解凍細(xì)胞，待細(xì)胞中完全解凍后用離心機(jī)1500rpm/min離心5min，超凈工作臺(tái)中棄去凍存管中的上清液，加入1ml 細(xì)胞生長(zhǎng)液輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)入底面積為35cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加 8ml 的細(xì)胞生長(zhǎng)液，前后左右混勻后于含5% CO₂的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)8-10h，貼壁率達(dá)70%以上時(shí)換液，恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至單層。

 

細(xì)胞傳代培養(yǎng)

復(fù)蘇的細(xì)胞長(zhǎng)至致密單層時(shí)，在細(xì)胞間超凈工作臺(tái)中進(jìn)行傳代。

①   棄去細(xì)胞瓶中培養(yǎng)液，并用 1×PBS 洗兩次，每次 5ml（動(dòng)作溫和，防止細(xì)胞脫落）；

②   加入 1ml 細(xì)胞消化液，完全浸潤(rùn)細(xì)胞表面 15s，棄瓶中消化液，倒置，放入 37℃恒 溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中 10min

③   細(xì)胞完全消化后（細(xì)胞面疏松，輕拍細(xì)胞瓶，細(xì)胞完全脫落即完全消化），加入 5ml 細(xì)胞生長(zhǎng)液，用 10ml 的移液管反復(fù)吹吸（動(dòng)作溫和，防止損傷細(xì)胞）制成單細(xì)胞懸液；

④   補(bǔ)加14ml 細(xì)胞生長(zhǎng)液，混勻后分裝至兩個(gè)底面積35cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于含5% CO2 的 37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其中一瓶用于接種CVB5 病毒，另一瓶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)備用。

 

細(xì)胞凍存

細(xì)胞貼壁率達(dá)到 80%-90%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用 1×PBS 輕洗兩次，棄去 PBS，按上述細(xì)胞傳代中消化細(xì)胞的方法進(jìn)行消化，待細(xì)胞消化完全時(shí)加入細(xì)胞凍存液來(lái)終止消化，輕輕吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×106 /ml，分裝至細(xì)胞凍存管，體積為 1ml/管，密封。按以下順序 4℃，1h；-20℃，1.5h；-40℃，1h；-80℃，過(guò)夜；第二天將其放入液氮罐中，完全浸沒(méi)于液氮，長(zhǎng)期凍存?zhèn)溆谩?

 

各種原代細(xì)胞培養(yǎng)

①     取組織，放入平皿中。用PBS液洗組織2～3次。

②     剪碎胚體，用PBS液振蕩洗滌，靜置片刻，待胚塊沉淀后吸去上清，重復(fù)3次。 

③     加胰酶（終濃度0.625%），置37℃消化至胚塊“起毛”（大組織塊邊緣似纖毛運(yùn)動(dòng)）。

④     加入含小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，用滴管反復(fù)吹打至見不到組織塊。 

⑤     用200目細(xì)胞篩過(guò)濾至離心管中，離心10 min。

⑥     棄上清，加入少量生長(zhǎng)液吹散細(xì)胞沉淀，加適量生長(zhǎng)液，分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。