操作實驗細菌轉(zhuǎn)化的步驟是怎么樣?
一、原理
質(zhì)粒DNA粘附在細菌細胞表面,經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理,促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達,就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
二、器材
旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?,制冰機,恒溫搖床,培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養(yǎng)箱。
三、試劑
培養(yǎng)基(不加抗菌素),LB培養(yǎng)基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal.
四、實驗準(zhǔn)備
無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
五、操作步驟
(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。
(3) 加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。
(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。
(5) 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.
(6) 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂)。
(7) 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。
(9) 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。
(10)觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
質(zhì)粒DNA粘附在細菌細胞表面,經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理,促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達,就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
二、器材
旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?,制冰機,恒溫搖床,培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp),超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養(yǎng)箱。
三、試劑
培養(yǎng)基(不加抗菌素),LB培養(yǎng)基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal.
四、實驗準(zhǔn)備
無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
五、操作步驟
(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min。
(3) 加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過100ng),輕輕震蕩后放置冰上20min。
(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min。
(5) 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.
(6) 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂)。
(7) 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。
(9) 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。
(10)觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。
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