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朱云飛 / 2019-06-20
1關(guān)鍵詞：膽堿、膽堿氧化酶、過氧化物酶、磷脂酶D
一、膽堿
膽堿是一種強有機堿，是卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂之中，是機體可變甲基的一個來源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，同時又是乙酰膽堿的前體。
膽堿對人體的作用相當廣泛，如促進腦發(fā)育和提高記憶能力、調(diào)控細胞凋亡、促進脂肪代謝、促進體內(nèi)甲基代謝、降低血清膽固醇等。因此，在乳品中添加膽堿越來越受到重視，世界許多國家，包括中國在內(nèi)，均已將膽堿批準作為營養(yǎng)食品添加劑。

國標GB5413.20-2013嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定中規(guī)定了兩種方法，酶比色法和雷氏鹽分光光度法。鑒于目前傳統(tǒng)的檢測方法（雷氏鹽比色法）不同程度的存在操作繁瑣、選擇性差、干擾因素多等缺陷，一般大型企業(yè)都會選擇酶比色法。

二、膽堿的含量測定方法（酶比色法）
1、原理：膽堿經(jīng)酸水解后邊成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。
2、試劑
鹽酸（1mol/L）:量取85ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
鹽酸（3mol/L）：量取125ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
氫氧化鈉溶液（500g/L）：稱取500g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000ml；
Tris緩沖溶液（0.05mol/L，PH=8.0±0.2）：稱取6.057g三羥基氨基甲烷溶于500ml蒸餾水中，用1mol/L鹽酸調(diào)PH至8.0±0.2，用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在4℃冰箱可保存一個月；
酶反應(yīng)顯色劑：取100-120活力單位的膽堿氧化酶、250-280活力單位的過氧化物酶、75-100活力單位的磷脂酶D、15mg 4-氨基安替比林和50ml苯酚置于100ml的容量瓶中，用0.05mol/L Tris緩沖液稀釋至刻度。（現(xiàn)用現(xiàn)配）
膽堿氫氧化物標準品：稱取102±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度即為儲備液（冰箱冷藏不超過1周）；吸取儲備液10.0ml溶液與100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度即為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
3、簡易步驟
3.1樣品制備：稱取5g混合均勻的固體樣品（液體20g），于100ml錐形瓶中，加入30ml1mol/L鹽酸溶液（液體樣品10ml 3mol/L鹽酸溶液）；70℃水浴，水解3小時（每隔半小時搖勻一次），冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH為3.5-4.0，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中用蒸餾水定容；過濾水解液，濾液應(yīng)是澄清，否則再慮，濾液放冰箱冷藏可保存3天。
3.2標曲制作：分別吸取2ml、4ml、6ml、8ml膽堿標準工作液于10ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度；準備6支試管，一個做空白加入0.1ml蒸餾水，另5支分別加入0.1ml標準溶液和4個稀釋梯度，再每個試管加入3ml酶反應(yīng)顯色劑；用密封保護膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應(yīng)15min；時間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長505nm處，用蒸餾水做空白，測定吸光值制作標準曲線。
3.3樣品測定：將每個樣品準備2支試管，分別加入0.1ml樣品濾液，一個加入蒸餾水3ml做空白，一個加入3ml酶反應(yīng)顯色劑；用密封保護膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反應(yīng)15min；時間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長505nm處，用蒸餾水做空白，測定吸光值，然后計算樣品中膽堿的含量。
三、酶比色法中源葉能為您提供的試劑
1、膽堿氧化酶：CAS號 9028-67-5  源葉貨號S31014
2、過氧化物酶：CAS號 9003-99-0
源葉貨號S10061、S10062、S10063、S10064（不同純度的）