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【貴陽生物實(shí)驗(yàn)室】:膽堿在乳品中的應(yīng)用和測(cè)定
1關(guān)鍵詞：膽堿、膽堿氧化酶、過氧化物酶、磷脂酶D
一、膽堿
膽堿是一種強(qiáng)有機(jī)堿，是卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂之中，是機(jī)體可變甲基的一個(gè)來源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，同時(shí)又是乙酰膽堿的前體。
膽堿對(duì)人體的作用相當(dāng)普遍，如促進(jìn)腦發(fā)育和進(jìn)步記憶才能、調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進(jìn)脂肪代謝、促進(jìn)體內(nèi)甲基代謝、降低血清膽固醇等。因而，在乳品中添加膽堿越來越遭到注重，世界許多國度，包括中國在內(nèi)，均已將膽堿批準(zhǔn)作為營養(yǎng)食品添加劑。
國標(biāo)GB5413.20-2013嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定中規(guī)則了兩種辦法，酶比色法和雷氏鹽分光光度法。鑒于目前傳統(tǒng)的檢測(cè)辦法（雷氏鹽比色法）不同水平的存在操作繁瑣、選擇性差、干擾要素多等缺陷，普通大型企業(yè)都會(huì)選擇酶比色法。
二、膽堿的含量測(cè)定辦法（酶比色法）
1、原理：膽堿經(jīng)酸水解后邊成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反響生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。
2、試劑
鹽酸（1mol/L）:量取85ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
鹽酸（3mol/L）：量取125ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
氫氧化鈉溶液（500g/L）：稱取500g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000ml；
Tris緩沖溶液（0.05mol/L，PH=8.0±0.2）：稱取6.057g三羥基氨基甲烷溶于500ml蒸餾水中，用1mol/L鹽酸調(diào)PH至8.0±0.2，用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在4℃冰箱可保管一個(gè)月；
酶反響顯色劑：取100-120生機(jī)單位的膽堿氧化酶、250-280生機(jī)單位的過氧化物酶、75-100生機(jī)單位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林和50ml苯酚置于100ml的容量瓶中，用0.05mol/L Tris緩沖液稀釋至刻度。（現(xiàn)用現(xiàn)配）
膽堿氫氧化物規(guī)范品：稱取102±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度即為儲(chǔ)藏液（冰箱冷藏不超越1周）；汲取儲(chǔ)藏液10.0ml溶液與100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度即為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
3、簡(jiǎn)易步驟
3.1樣品制備：稱取5g混合平均的固體樣品（液體20g），于100ml錐形瓶中，參加30ml1mol/L鹽酸溶液（液體樣品10ml3mol/L鹽酸溶液）；70℃水浴，水解3小時(shí)（每隔半小時(shí)搖勻一次），冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH為3.5-4.0，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中用蒸餾水定容；過濾水解液，濾液應(yīng)是廓清，否則再慮，濾液放冰箱冷藏可保管3天。
3.2標(biāo)曲制造：分別汲取2ml、4ml、6ml、8ml膽堿規(guī)范工作液于10ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度；準(zhǔn)備6支試管，一個(gè)做空白參加0.1ml蒸餾水，另5支分別參加0.1ml規(guī)范溶液和4個(gè)稀釋梯度，再每個(gè)試管參加3ml酶反響顯色劑；用密封維護(hù)膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反響15min；時(shí)間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長505nm處，用蒸餾水做空白，測(cè)定吸光值制造規(guī)范曲線。
1、膽堿氧化酶：CAS號(hào)9028-67-5 源葉貨號(hào)S31014
2、過氧化物酶：CAS號(hào)9003-99-0
源葉貨號(hào)S10061、S10062、S10063、S10064（不同純度的）
3、磷脂酶D : CAS號(hào)9001-87-0 源葉貨號(hào) S25117、S31760
4、4-氨基安替比林: CAS號(hào)83-07-8 源葉貨號(hào) B34212
一、膽堿
膽堿是一種強(qiáng)有機(jī)堿，是卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂之中，是機(jī)體可變甲基的一個(gè)來源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，同時(shí)又是乙酰膽堿的前體。
膽堿對(duì)人體的作用相當(dāng)普遍，如促進(jìn)腦發(fā)育和進(jìn)步記憶才能、調(diào)控細(xì)胞凋亡、促進(jìn)脂肪代謝、促進(jìn)體內(nèi)甲基代謝、降低血清膽固醇等。因而，在乳品中添加膽堿越來越遭到注重，世界許多國度，包括中國在內(nèi)，均已將膽堿批準(zhǔn)作為營養(yǎng)食品添加劑。
國標(biāo)GB5413.20-2013嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測(cè)定中規(guī)則了兩種辦法，酶比色法和雷氏鹽分光光度法。鑒于目前傳統(tǒng)的檢測(cè)辦法（雷氏鹽比色法）不同水平的存在操作繁瑣、選擇性差、干擾要素多等缺陷，普通大型企業(yè)都會(huì)選擇酶比色法。
二、膽堿的含量測(cè)定辦法（酶比色法）
1、原理：膽堿經(jīng)酸水解后邊成游離態(tài)的膽堿，再經(jīng)酶氧化后與顯色劑反響生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與膽堿含量成正比。
2、試劑
鹽酸（1mol/L）:量取85ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
鹽酸（3mol/L）：量取125ml的濃鹽酸加水稀釋至1000ml；
氫氧化鈉溶液（500g/L）：稱取500g氫氧化鈉，溶于水并稀釋至1000ml；
Tris緩沖溶液（0.05mol/L，PH=8.0±0.2）：稱取6.057g三羥基氨基甲烷溶于500ml蒸餾水中，用1mol/L鹽酸調(diào)PH至8.0±0.2，用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在4℃冰箱可保管一個(gè)月；
酶反響顯色劑：取100-120生機(jī)單位的膽堿氧化酶、250-280生機(jī)單位的過氧化物酶、75-100生機(jī)單位的磷脂酶D、15mg4-氨基安替比林和50ml苯酚置于100ml的容量瓶中，用0.05mol/L Tris緩沖液稀釋至刻度。（現(xiàn)用現(xiàn)配）
膽堿氫氧化物規(guī)范品：稱取102±2℃烘至恒重的膽堿酒石酸氫鹽523mg置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度即為儲(chǔ)藏液（冰箱冷藏不超越1周）；汲取儲(chǔ)藏液10.0ml溶液與100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度即為工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。
3、簡(jiǎn)易步驟
3.1樣品制備：稱取5g混合平均的固體樣品（液體20g），于100ml錐形瓶中，參加30ml1mol/L鹽酸溶液（液體樣品10ml3mol/L鹽酸溶液）；70℃水浴，水解3小時(shí)（每隔半小時(shí)搖勻一次），冷卻，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH為3.5-4.0，轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中用蒸餾水定容；過濾水解液，濾液應(yīng)是廓清，否則再慮，濾液放冰箱冷藏可保管3天。
3.2標(biāo)曲制造：分別汲取2ml、4ml、6ml、8ml膽堿規(guī)范工作液于10ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度；準(zhǔn)備6支試管，一個(gè)做空白參加0.1ml蒸餾水，另5支分別參加0.1ml規(guī)范溶液和4個(gè)稀釋梯度，再每個(gè)試管參加3ml酶反響顯色劑；用密封維護(hù)膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反響15min；時(shí)間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長505nm處，用蒸餾水做空白，測(cè)定吸光值制造規(guī)范曲線。
3.3樣品測(cè)定：將每個(gè)樣品準(zhǔn)備2支試管，分別參加0.1ml樣品濾液，一個(gè)參加蒸餾水3ml做空白，一個(gè)參加3ml酶反響顯色劑；用密封維護(hù)膜蓋住試管，混勻，把試管置于37℃水浴中保溫反響15min；時(shí)間到后將溶液取出冷卻至室溫，再波長505nm處，用蒸餾水做空白，測(cè)定吸光值，然后計(jì)算樣品中膽堿的含量。
1、膽堿氧化酶：CAS號(hào)9028-67-5 源葉貨號(hào)S31014
2、過氧化物酶：CAS號(hào)9003-99-0
源葉貨號(hào)S10061、S10062、S10063、S10064（不同純度的）
3、磷脂酶D : CAS號(hào)9001-87-0 源葉貨號(hào) S25117、S31760
4、4-氨基安替比林: CAS號(hào)83-07-8 源葉貨號(hào) B34212
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膽堿
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