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一、MTT 是什么

MTT是一種粉末狀化學(xué)試劑，漢語化學(xué)名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。微溶于甲醇，但難溶于水或乙醇；用醚、丙酮或乙酸乙酯也不能將其完全溶解。

二、MTT法用來做什么

簡單地說：是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。

MTT主要有兩個(gè)用途

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定;

2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。

三、為何MTT可以用來做上述工作

檢測原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在540nm波長處測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。

四、實(shí)驗(yàn)所需材料

1.MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g

1.1對于100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱量分裝，而應(yīng)該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預(yù)先在50ml離心管(沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代)加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜?fù)幾次，以使小管中的MTT不殘留于管內(nèi)。將MTT完全混勻后，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存于-20度。按細(xì)胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計(jì)算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml。

1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加。

注意事項(xiàng)：

在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。

配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感

MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4度避光保存兩周內(nèi)(個(gè)人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯(cuò))有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用。

MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.

2.MTT甲瓚溶解液

2.1二甲基亞砜DMSO，可以直接溶解，無需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養(yǎng)液，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會(huì)把結(jié)晶去掉，導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。

2.2三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液(文獻(xiàn)方法：周建軍等，評價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24(10)：455-457)，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基，但溶解較慢。(個(gè)人覺得其溶解的能力不如DMSO強(qiáng))

該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。

五、MTT法實(shí)驗(yàn)步驟

1.胰酶消化對數(shù)期細(xì)胞，終止后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至5-10×104/ml。

細(xì)胞詳細(xì)計(jì)數(shù)方法請參照易生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的相關(guān)文章。

對于初學(xué)者而言，要使細(xì)胞達(dá)到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個(gè)簡單的方法以初步確定細(xì)胞數(shù)量。

以一般細(xì)胞培養(yǎng)常用的25cm2為例:

1)細(xì)胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為80%~90%密度時(shí)細(xì)胞的大致狀態(tài))，消化離心收集后，將上清去掉，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻。

2)另取一支新的15ml無菌離心管(為下一步接種96孔板用)，裝入約9ml培養(yǎng)基.

3)從第一步準(zhǔn)備的3ml細(xì)胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻后細(xì)胞計(jì)數(shù)，此時(shí)一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當(dāng)于細(xì)胞計(jì)數(shù)板4個(gè)大格內(nèi)每大格平均5-10個(gè)細(xì)胞(見下圖);如果不夠該濃度，再根據(jù)計(jì)數(shù)的結(jié)果滴加細(xì)胞懸液，每滴按50ul計(jì)算。

4)細(xì)胞數(shù)量因?qū)嶒?yàn)?zāi)康牟煌瑧?yīng)做相應(yīng)調(diào)整，如一般細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔2000個(gè)就可以(相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為2×104/ml)，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔5000—10000個(gè)(相當(dāng)于細(xì)胞懸液密度為5×104/ml)。此外，還應(yīng)根據(jù)細(xì)胞本身特性，如生長快慢，來決定細(xì)胞數(shù)量。比如：生長較快的細(xì)胞密度可略小。

2.將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細(xì)胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。

注意：因細(xì)胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復(fù)多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同，這對于MTT的結(jié)果至關(guān)重要。

3.將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)6個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況。下圖可做為96孔板的的參考步局。

對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認(rèn)為應(yīng)盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，這樣能保證藥物濃度的準(zhǔn)確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥，應(yīng)該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細(xì)胞死亡。

4.5% CO₂，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。

5.每孔加入30μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

6. 終止培養(yǎng)，準(zhǔn)備溶解結(jié)晶。

溶解結(jié)晶的方法有兩種，第一種，用DMSO溶解

1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結(jié)晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙?jiān)谧烂?，然后?span>96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結(jié)果的損失。個(gè)人認(rèn)為，這兩種方法都有可能導(dǎo)致結(jié)晶的損失，從而引起結(jié)果的不準(zhǔn)確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再?zèng)Q定。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

另一種方法，用三聯(lián)溶解液

1) MTT加入培養(yǎng)4h后，結(jié)晶可充分形成。這種方法細(xì)胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結(jié)晶全部溶解后再使用。)

2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時(shí)，鏡下觀察，待結(jié)晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結(jié)晶會(huì)全部溶解。如果紫色結(jié)晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì)短一些。如果紫色結(jié)晶較大較多，溶解的時(shí)間會(huì)長一些。

在實(shí)際的操作過程中，往往為了等待4—6小時(shí)，使得實(shí)驗(yàn)者在下班以后或者晚上來測OD值，給實(shí)驗(yàn)者帶來了很大的不方便。加入溶解液后過夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yǎng)箱關(guān)閉后本身就是閉光的，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天再測OD值就可以了。

7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。

六、MTT結(jié)果分析

關(guān)于如何計(jì)算IC50

1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應(yīng)率之和

Pm:最大陽性反應(yīng)率

Pn:最小陽性反應(yīng)率

舉個(gè)例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT值如下

藥物濃度ug/ml	100	50	25	12.5	6.25	3.125	0
OD均值	0.080	0.093	0.236	0.374	0.441	0.531	0.614

公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率

抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物，

其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：

藥物濃度ug/ml	100	50	25	12.5	6.25	3.125
抑制率	0.869	0.849	0.616	0.391	0.282	0.135

代入計(jì)算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

該藥物的IC50值為45.186ug/ml